實驗一 爪蟾人工繁殖、受精和胚胎發育 - 圖文 - 下載本文

實驗二 爪蟾人工繁殖、受精和胚胎發育

一、實驗目的:了解爪蟾的生活和繁殖習性,掌握爪蟾人工繁殖技術;通過對爪蟾從受精卵經卵裂、囊胚、原腸胚到神經胚的系列發育過程的觀察,了解其胚胎早期發育過程和形態模式形成的特征。 二、爪蟾的生活和繁殖習性

非洲爪蟾(Xenopus laevis)原產非洲南部的一種水生蛙類,又名光滑爪蟾,屬于兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、負子蟾科(Pipidae)、爪蟾屬(Xenopus)。其頭部及身體扁平,沒有外耳或舌頭,其后腳上3趾有短爪。雌性成蛙體長9-14cm,在身體尾端的泄殖腔上方有分列左右的兩瓣膜。雄性成蛙體長7-11cm,性成熟的雄蛙前肢有黑色婚墊,便于交配,泄殖腔上方無瓣膜。

圖2-1 非洲爪蟾和熱帶爪蟾成體形態

非洲爪蟾產卵量很大,為多次產卵類型的蛙類。在25℃養殖條件下可以不受季節限制而常年產卵。其卵子和胚胎體積較大,便于進行實驗胚胎學操作,如顯微注射、胚胎切割和移植等。受精后胚胎發育很快,在24℃下受精后2天左右就可以孵化成可以游動的蝌蚪。非洲爪蟾蝌蚪在早期是透明的,能夠看清楚它內部的結構。因此,非洲爪蟾長期以來被作為實驗胚胎學和脊椎動物胚胎形體模式形成的模式動物。但由于其基因組是在進化上二倍體化了的四倍體,多數基因存在四個拷貝,很難進行遺傳突變實驗。因此,近年來非洲爪蟾的近親——二倍體的熱帶爪蟾Xenopus tropicalis 被引入發育生物學的研究中。熱帶爪蟾其外型與非洲爪蟾類似,但體型較小(圖2-1)。幾乎所有使用在非洲爪蟾的研

究技術都可在熱帶爪蟾上應用,而且熱帶爪蟾的基因組測序計劃已在2010年基本完成。因此,熱帶爪蟾成為了功能基因組學和發育生物學研究的優良的實驗動物模型。

三、實驗器材和材料

爪蟾養殖系統,小型塑料整理箱(直徑約58cm)兩個,加熱棒,加氣泵,12cm培養皿若干,9cm培養皿若干,數個膠頭滴管,0.5ml (U-40)注射器、絨毛膜促性腺激素(HCG),曝氣水10L,瓊脂糖,0.1×MMR, 半胱氨酸(L-Cysteine Free Base),性成熟雌、雄性熱帶爪蟾。 四、實驗內容和程序

1、爪蟾的選取:在實驗前一天的晚上,用小型塑料盆盛1/3的干凈曝氣水,調節水溫至25℃(尤其是冬天時,水溫較低,一定要注意水的溫度,以防止爪蟾在冷水里不適應出現休克等現象)為催產用。然后挑選用于進行催產的性成熟雌蛙和雄蛙。雌、雄蛙按照上述性別特征進行鑒別:個體較大、腹部大,泄殖腔上方有瓣膜,前爪沒有明顯黑色線的為雌蛙;個體較小、泄殖腔上方無瓣膜,前爪內側有明顯的黑色線條為性成熟的雄蛙。

2、爪蟾的預處理:用酒精消過毒的U-40注射器吸取配好的HCG溶液,按照預處理注射的HCG含量(20國際單位), 從爪蟾后端背部注射到皮下。將處理好的雌蛙和雄蛙分別放入準備好的水盆中后置于25℃培養箱中,培養過夜。 3、爪蟾的催產:取出預處理雌蛙和雄蛙,雌蛙注射200國際單位的HCG、雄蛙注射150單位單位,將注射好的雌雄蛙放于同一塑料盆中,避光置于25°恒溫培養箱中,等待爪蟾抱對產卵。

4、抱對產卵:在注射HCG 2-3h 之后,雄雌蛙會抱對產卵。在此過程中,不要驚擾抱對的雄雌蛙,待產卵結束后,將爪蟾轉移到另一塑料盆,用膠頭滴管受精卵吸出。

5、膠膜去除和胚胎觀察:將受精卵放入2%半胱氨酸,0.1×MMR(PH=8.0,溶液配制見本節附錄)溶液中,在玻璃燒杯中輕輕旋轉,約5分鐘后,膠膜脫離,再用0.1×MMR漂洗3-5次,然后將卵放入有1%瓊脂糖(0.1×MMR)鋪底的裝有0.1×MMR培養皿中,于25℃進行胚胎培養。隨時觀察和記錄受精卵的變化和胚胎發育的變化過程和時序。

五、熱帶爪蟾胚胎發育的觀察的基本內容和作業

爪蟾的卵屬于中黃卵(mesolecithal egg),進行輻射式的完全卵裂。通過觀察爪蟾從受精卵發育成具有自主生活能力的個體的過程,解蛙卵受精后的變化過程、形態模式形成的特點和過程。具體內容包括觀察、作圖并記錄下述發育過程和時序:

1、受精卵的變化和卵裂的特點; 2、多細胞胚胎——囊胚的形成;

3、原腸形態發生運動過程中細胞運動的方式和特點,形成的原腸胚特點及各胚層的分布;

4、神經胚時期的特點及神經板,神經管的形成;

5、器官發生——腦部、眼睛、耳朵、骨骼、肌肉、消化系統、循環系統等主要器官的形成。

附錄一:爪蟾生活史(引自Lewis Wolpert等,2001)

附錄二:爪蟾胚胎發育圖譜和時序(引自Nieuwkoop and Faber,1994)





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